Учёные выявили скрытую проблему в технологии секвенирования РНК отдельных клеток

Фумио Накаки объединил теоретическое моделирование с экспериментальными тестами и использовал общедоступные наборы данных отдельных клеток для оценки того, как мультиплексирование образцов влияет на обнаружение мультиплетов. Автор: Фумио Накаки/EMBL

Секвенирование РНК отдельных клеток (scRNA-seq) произвело революцию в современной биологии, позволив ученым изучать экспрессию генов из тысяч отдельных клеток одновременно. Эта техника помогает исследователям идентифицировать различные популяции клеток, изучать клеточную гетерогенность и понимать динамику экспрессии генов в сложных тканях.

В недавнем исследовании ученые из EMBL Барселона предоставили новые данные о некоторых технических ограничениях процесса, которые могут помочь ученым лучше учитывать эти риски при проектировании экспериментов scRNA-seq.

Распространенный метод scRNA-seq использует микрофлюидное устройство, генерирующее миллионы «микрокапель». Каждая клетка захватывается в отдельной микрокапле, а затем подвергается биохимическому профилированию. Однако в случайных случаях несколько клеток захватываются одновременно в одной микрокапле и ошибочно распознаются как одна клетка (так называемый «мультиплет»).

Этот скрытый артефакт может искажать данные и вводить в заблуждение при интерпретации экспериментов. Один из способов снизить риск мультиплетов — «мультиплексирование образцов», техника, при которой образцы маркируются различными молекулярными штрих-кодами, а мультиплеты можно отличить по наличию нескольких штрих-кодов в одной микрокапле. Хотя эта стратегия улучшила рентабельность и дизайн экспериментов, оставалось неясным, сохраняется ли при этом риск скрытых мультиплетов.

В новом исследовании Фумио Накаки, постдокторант группы Шарпа в EMBL Барселона, количественно оценил риск необнаруженных (или «скрытых») мультиплетов при мультиплексировании образцов как в теории, так и на практике. Работа была опубликована в BMC Genomics.

«Наша цель — предоставить исследователям практический ориентир, — сказал Накаки. — Мультиплексирование образцов широко используется, но его ограничения часто упускаются из виду. Прояснив, как и когда возникают мультиплеты в условиях мультиплексирования, мы надеемся, что эта работа поможет улучшить дизайн исследований в экспериментах и интерпретацию данных».

Чтобы оценить, как мультиплексирование образцов влияет на обнаружение мультиплетов, Накаки объединил теоретическое моделирование с экспериментальными тестами и использовал общедоступные наборы данных отдельных клеток. Он вывел математические выражения для оценки ожидаемых частот мультиплетов при различных входных условиях и проверил эти прогнозы на реальных данных, где отдельные образцы были уникально штрих-кодированы.

Сравнивая различные конфигурации мультиплексирования, Накаки показал, что хотя мультиплексирование образцов помогает идентифицировать некоторые типы мультиплетов, по крайней мере один тип мультиплетов все еще остается, особенно в условиях, когда маркировка образцов была недостаточной или выбор инструментов анализа был неадекватным.

Их анализ предоставляет практические рекомендации о том, как сбалансировать ввод клеток, количество образцов и желаемую специфичность, подчеркивая, что даже при мультиплексировании экспериментальные параметры должны быть тщательно оптимизированы для сохранения целостности данных отдельных клеток.

Больше информации: Fumio Nakaki et al, Probability of stealth multiplets in sample-multiplexing for droplet-based single-cell analysis, BMC Genomics (2025). DOI: 10.1186/s12864-025-11835-z

Источник: European Molecular Biology Laboratory