Ученые разработали метод для повышения эффективности геномного редактирования CRISPR

Ученые из Детской исследовательской больницы Св. Иуды разработали высокопроизводительный метод скрининга, который позволяет значительно повысить эффективность и точность систем геномного редактирования, известных как CRISPR-ассоциированные транспозоны (CAST).

Сон Гук Пак, доктор философии, и автор-корреспондент Элизабет Келлог, доктор философии, из Департамента структурной биологии St. Jude, разработали высокопроизводительный подход, позволивший быстро тестировать и оптимизировать перспективные инструменты для редактирования генов под названием CAST. Автор: St. Jude Children's Research Hospital

Природные системы, такие как CRISPR-ассоциированные транспозоны (CAST), предлагают целевой одноэтапный способ редактирования геномов. Однако их адаптация для биомедицинских применений до сих пор была сопряжена с трудностями.

Чтобы решить эту проблему, ученые разработали подход для скрининга, который позволяет точно измерять эффективность и специфичность тысяч вариантов CAST. Этот высокопроизводительный метод позволил исследователям быстро оптимизировать наиболее перспективные кандидаты, раскрывая фундаментальные механистические аспекты, важные для дальнейшей инженерии и потенциального клинического использования.

Результаты работы были опубликованы в журнале Nucleic Acids Research.

CAST, открытые в 2017 году, интегрируют крупные фрагменты ДНК в геном в местах, определяемых заданной последовательностью РНК. Они обладают высокой специфичностью в бактериях, своих естественных хозяевах, но гораздо менее эффективны в клетках человека.

Автор-корреспондент исследования Элизабет Келлог, доктор философии из Департамента структурной биологии St. Jude, заинтересована в доработке CAST для повышения их применимости к человеку и другим организмам. Для этого необходим быстрый способ оценки сильных и слабых сторон сконструированных систем.

«Главным пробелом в понимании CAST было не просто измерение их общей активности, но и того, насколько точно они интегрируют ДНК в заданные места, — сказала Келлог. — Просто не существовало масштабируемого способа охарактеризовать их специфичность».

Автор: Nucleic Acids Research (2025). DOI: 10.1093/nar/gkaf917

Поиск специфичности и эффективности

Чтобы восполнить этот пробел, исследователи разработали высокопроизводительный скрининг для измерения относительной активности и специфичности тысяч вариантов CAST в одном эксперименте. Сосредоточившись на подтипе V-K CAST, который менее сложен, чем другие, они смогли вносить небольшие изменения в его белки и быстро тестировать мутанты.

«Мы хотели проскринировать библиотеку со всеми возможными единичными мутациями, чтобы изучить мутационный ландшафт системы CAST, — сказал соавтор Сон Гук Пак, доктор философии из Департамента структурной биологии. — Мы не фокусировались на конкретных регионах; вместо этого мы протестировали их все, чтобы найти мутации, которые могли бы улучшить активность или специфичность».

После скрининга мутаций V-K CAST исследователи объединили несколько наиболее перспективных мутаций, чтобы проверить, является ли их положительный эффект аддитивным.

«Всего несколько мутаций привели к пятикратному увеличению активности, — отметила Келлог. — Мы улучшили как специфичность, так и активность, не жертвуя ни тем, ни другим, что было невозможно при использовании предыдущих стратегий».

Келлог планирует продолжать работу над улучшением дизайна CAST. Теперь, когда этот метод скрининга доступен, она настроена оптимистично. «Природная система очень сложна, поэтому нам необходимо разрабатывать более минималистичные системы, — пояснила Келлог. — Но этот скрининг теперь позволяет нам быть более амбициозными в нашем белковом дизайне, чтобы мы могли в конечном итоге достичь этой цели».

Больше информации: Seong Guk Park et al, Comprehensive profiling of activity and specificity of RNA-guided transposons reveals opportunities to engineer improved variants, Nucleic Acids Research (2025). DOI: 10.1093/nar/gkaf917