Представлен компактный фермент Cas9d — перспективный инструмент для редактирования генома

Активность расщепления NsCas9d и структурная модель тройного комплекса. Автор: Группа Ван Яньли

Исследовательская группа под руководством профессора Ван Яньли из Института биофизики Китайской академии наук раскрыла структуру и механизм высокоактивного фермента Cas9 типа II-D, предложив новый перспективный инструмент для редактирования генома. Исследование было опубликовано 11 августа в журнале Nature Communications.

Белок Cas9 является ключевым для систем CRISPR-Cas типа II, причем Cas9 из Streptococcus pyogenes (SpCas9) наиболее широко используется благодаря высокой эффективности расщепления и мощной производительности при редактировании генома. Однако его большая молекулярная масса ограничивает доставку с помощью векторов адено-ассоциированного вируса (AAV). Поэтому поиск природных или созданных инженерным путем вариантов Cas9 с меньшим размером молекулы, но сопоставимой активностью расщепления, стал важной задачей.

В этой работе исследователи сосредоточились на Cas9 типа II-D, полученном из бактерии Nitrospirae (NsCas9d), который состоит всего из 762 аминокислот. Используя метагеномные данные, ученые идентифицировали CRISPR-повторы и спейсеры, ассоциированные с NsCas9d, и разработали соответствующую sgRNA.

Эксперименты по расщеплению in vitro показали, что NsCas9d требует как минимум 20-нуклеотидного спаривания между субстратной двуцепочечной ДНК и sgRNA для достижения высокой активности расщепления, сравнимой с SpCas9.

Анализы истощения PAM в сочетании с высокопроизводительным секвенированием выявили, что NsCas9d распознает последовательность PAM 5′-NRG-3′, причем PAM 5′-NGG-3′ демонстрирует наивысшую эффективность расщепления in vitro.

Исследователи также определили методом криоэлектронной микроскопии структуру тройного комплекса NsCas9d-sgRNA-двуцепочечной ДНК с разрешением 2,86 ангстрем, что стало первым сообщением о полной структуре доменов HNH и RuvC для Cas9 типа II-D.

В структурной модели последовательность PAM двуцепочечной ДНК размещается в позитивно заряженном связывающем канале, образованном доменами PI и WED. Важно, что NsCas9d генерирует в качестве продуктов расщепления «липкие концы» с 3-нуклеотидным 5′-выступом, что может повышать эффективность и предсказуемость процессов репарации ДНК во время таких операций редактирования генов, как вставки.

Это исследование не только углубляет понимание эволюции и молекулярных механизмов Cas9, но и подчеркивает потенциал NsCas9d как компактного и эффективного инструмента для применения в редактировании генома.

Больше информации: Kangkang Wang et al, Structural insights into Type II-D Cas9 and its robust cleavage activity, Nature Communications (2025). DOI: 10.1038/s41467-025-62128-8

Источник: Chinese Academy of Sciences