Японские ученые ускорили сборку ДНК в 5 раз с помощью наночастиц серебра

Новая технология с использованием наночастиц серебра может сделать сборку ДНК значительно эффективнее. Credit: Shutterstock

Японские ученые разработали метод, использующий наночастицы серебра для разрезания и соединения ДНК в заданных участках. Новая технология позволяет повысить эффективность сборки ДНК в два-пять раз по сравнению с традиционными методами, использующими ферменты рестрикции. Результаты исследования опубликованы в журнале Nucleic Acids Research.

ДНК состоит из длинных молекулярных цепей, несущих генетическую информацию. В генной инженерии исследователи разрезают ДНК в точно выбранных местах и соединяют фрагменты с другими последовательностями. Этот процесс лежит в основе множества применений: от улучшения сельскохозяйственных культур до лечения генетических заболеваний и создания животных моделей для разработки лекарств.

Для эффективного соединения коротких фрагментов ДНК ученые используют выступающие последовательности, называемые «липкими концами». Однако создание правильных «липких концов» требует высокоточной резки в определенных местах, с чем существующие технологии справляются не всегда.

Стандартные методы сборки длинных молекул ДНК обычно используют ферменты рестрикции для разрезания и ДНК-лигазу T4 для соединения фрагментов. Но рестрикционные ферменты узнают и разрезают только определенные последовательности ДНК, а также создают относительно короткие «липкие концы», что снижает эффективность соединения.

Команда под руководством профессора Хироси Абэ и доцента Масахито Инагаки из Университета Нагои совместно с профессором Нацухиса Ока из Университета Гифу исследовала возможность использования химических реакций для разрезания ДНК вместо ферментов.

Ученые обратились к реакции, впервые описанной в период с 1990 по 1992 год, в которой ионы серебра разрезают модифицированную ДНК в определенных местах. Ионы серебра эффективно резали ДНК, но также неспецифически связывались и вызывали выпадение осадка. В результате удавалось восстановить лишь около 14% ДНК, что слишком мало для практического применения.

Заменив ионы серебра наночастицами, исследователи обнаружили, что их можно отделить от реакционной смеси центрифугированием, что упрощает извлечение ДНК. Первоначальные эксперименты показали эффективность расщепления около 50% при 70°C и почти 100% при 95°C в течение двух часов. Однако такие температуры могут повредить длинные молекулы ДНК.

Для решения проблемы ученые покрыли наночастицы полиэтиленгликолем (ПЭГ), что повысило эффективность расщепления с 36% до 92% при 37°C за 31 час. «В итоге мы оптимизировали условия до практического уровня и при комнатных температурах достигли эффективности расщепления с модифицированным ПЭГ выше 91% при 50°C всего за один-два часа», — отметил Инагаки, первый автор исследования.

Наночастицы дали и другое важное преимущество: нежелательные фрагменты ДНК оставались на поверхности наночастиц, а нужные фрагменты с «липкими концами» оставались в растворе. Этот встроенный механизм очистки повысил конечный выход ДНК с 14% до 98%.

Наночастицы серебра также позволили создавать фрагменты ДНК с «липкими концами» из 8 оснований, которые трудно получить с помощью обычных ферментов. При соединении таких фрагментов ДНК-лигазой T4 эффективность была примерно вдвое выше, чем при традиционных методах. С более длинными выступами (18 оснований) эффективность соединения достигала 44%, тогда как традиционный метод с 4 основаниями давал лишь 8% — пятикратное преимущество.

Для проверки метода в практических биологических условиях команда собрала фрагмент ДНК, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), и ввела его в человеческие клетки HeLa. Клетки успешно экспрессировали GFP, подтвердив точность сборки ДНК.

«Мы считаем, что эта технология будет полезна для синтеза геномной ДНК и найдет применение в создании библиотек мРНК для вакцин против рака, генной терапии, разработке искусственных белковых лекарств и геномных культур», — прокомментировал Инагаки.

Исследователи теперь хотят выяснить, можно ли соединять более двух фрагментов ДНК одновременно. «Мы показали, что можно соединить два фрагмента. Теперь нужно подтвердить, можно ли соединять несколько фрагментов одновременно — это ключевой шаг для создания ДНК геномного масштаба», — объяснил ученый.

Работа поддержана Японским агентством науки и технологий (JST) и Японским агентством медицинских исследований и разработок (AMED).

Источники:

Материалы предоставлены Университетом Нагои.

Masahito Inagaki, Mikiya Kase, Haruka Hiraoka, Natsuhisa Oka, Fumitaka Hashiya, Naoko Abe, Yasuaki Kimura, Hiroshi Abe. Silver nanoparticle-induced site-specific strand cleavage of chemically modified oligonucleotides for long-chain DNA assembly. Nucleic Acids Research, 2026; 54 (11) DOI: 10.1093/nar/gkag525