Новый метод повышает точность срезов клеток для криоэлектронной томографии

Исследователи из Национальной ускорительной лаборатории SLAC Министерства энергетики США разработали метод, который значительно повышает точность подготовки ультратонких срезов клеток для криоэлектронной томографии (cryoET).

На переднем плане: черные точки показывают яркость кластера вирусов с флуоресцентной меткой внутри клетки-хозяина, которая фрезеруется сфокусированным ионным пучком. Красная линия — подобранная кривая, используемая для направления среза, чтобы оставшийся ультратонкий срез содержал интересующие вирусы. На заднем плане: тепловая карта флуоресценции с финального среза наложена на изображение, полученное методом криогенной электронной томографии, где круговые кластеры вирусов совпадают с наиболее яркой флуоресценцией. Автор: Энтони Сика/Питер Дальберг/Национальная ускорительная лаборатория SLAC.

Метод cryoET позволяет получать 3D-изображения внутренней архитектуры клеток с почти атомарным разрешением, пропуская электроны через замороженный образец. Однако электроны не могут проникнуть через большинство клеток, включая человеческие, если образец слишком толстый. Для этого клетки истончают до срезов толщиной 200 нанометров с помощью ионного пучка, но сложность заключается в том, чтобы нужная структура (например, рибосома или вирус) точно оказалась в этом тонком слое.

Как работает новая методика

Ученые объединили световую микроскопию с ионно-лучевым фрезерованием, используя так называемую три-совпадающую систему. Она совмещает фокальные плоскости трех инструментов: сканирующего электронного микроскопа, ионного пучка для фрезерования и оптического микроскопа для наблюдения за мельчайшими объектами, помеченными флуоресцентными метками.

Хотя такие системы обычно не могут разрешить объекты меньше 200 нанометров, команда использовала явление интерференции световых волн. По мере того как ионный пучок стачивает верхнюю часть клетки, флуоресцентный свет от целевого объекта отражается от поверхности образца и интерферирует с падающим светом, вызывая колебания яркости. Программное обеспечение, написанное исследователем Энтони Сика, анализирует эти паттерны затухания и усиления яркости, чтобы с высокой точностью определить местоположение объекта и направить фрезерование.

Результаты и перспективы

Новый подход повысил точность оптически управляемого фрезерования примерно на порядок. В ходе испытаний команда успешно получила изображение вируса шириной 26 нанометров, заражающего человеческую клетку.

«Наш подход с высокой точностью и успешностью показывает, где находится ваш объект внутри этого финального тонкого клеточного среза. Это также значительно повышает эффективность, так как вы тратите меньше времени на фрезерование и промахи мимо цели», — сказал доцент SLAC и Стэнфордского университета Питер Дальберг.

Техника может быть применена для изучения других вирусных частиц, крошечных временных структур, участвующих в делении клеток, и иных объектов, ранее недоступных для cryoET.

В будущем команда планирует внедрить в три-совпадающую систему более совершенные методы световой микроскопии, чтобы еще больше улучшить качество оптических изображений и получать максимально информативные снимки с помощью криоэлектронной томографии.

Источник: SLAC National Accelerator Laboratory