Двухэтапное редактирование генома позволяет создавать полноразмерные гуманизированные модели мышей

Исследователи из Института медицинских наук Токийского университета разработали новую платформу TECHNO (Two-step ES Cell-based HumaNizatiOn) для создания мышей с полноразмерными человеческими генами. Метод опубликован в журнале Nature Communications.

Существующие технологии с трудом позволяли эффективно вставлять очень крупные фрагменты генома. TECHNO решает эту проблему с помощью двухэтапной стратегии, сочетающей редактирование CRISPR/Cas9 с доставкой больших человеческих геномных регионов на основе бактериальных искусственных хромосом (BAC).

TECHNO: Двухэтапная стратегия редактирования генома. Автор: Доктор Манабу Озава / Токийский университет, Япония

Сначала целевой локус мыши удаляется и заменяется короткими участками человеческой гомологии с селекционной кассетой. Затем в эмбриональные стволовые клетки вводится BAC с полной человеческой версией гена и его регуляторными элементами, что позволяет интегрировать фрагменты размером более 200 тысяч пар оснований.

Учёные успешно гуманизировали несколько локусов, включая c-Kit, APOBEC3 и CYBB. Замена гена c-Kit воспроизвела характерное для человека альтернативное сплайсирование и орган-специфичную экспрессию. Гуманизация локуса APOBEC3 продемонстрировала масштабируемость метода — была интегрирована ДНК длиной более 200 тысяч пар оснований, охватывающая семь генов.

Также был создан гуманизированный аллель CYBB с мутациями, вызывающими хроническую гранулематозную болезнь. У полученных мышей наблюдалось нарушение выработки активных форм кислорода, что точно воспроизводит молекулярный фенотип пациентов.

В целом, эти результаты демонстрируют, что наш метод позволяет не только проводить полноразмерную гуманизацию отдельных локусов, но и точно моделировать человеческие генетические заболевания in vivo, вводя связанные с болезнью мутации в гуманизированные аллели, — заявил доктор Манабу Озава.

Платформа TECHNO представляет собой значительный шаг к созданию гуманизированных мышиных моделей нового поколения для изучения функций генов, моделирования заболеваний и доклинических испытаний лекарств.